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Nexera Method Scouting 시스템

-효율적인 분석법 개발을 위한 시스템- 기존의 분석 조건 탐색 과정은 분석법 개발에 있어서 복잡하고 시간 소모적인 경우가 있습니다. 여기서는 기존 분석법 개발 기술의 제한 요소를 식별하고 그 해결책을 제시하는 Nexera Method Scouting 시스템 및 관련 Application을 소개하고 있습니다.

  1. 분석법 개발 속도를 지연시키는 단계 1-4 단계 중 2단계인 Method Scouting에서 가장 많은 시간이 소모됩니다. 예를 들어, 불순물이나 천연물 분석, 광학 이성질체의 카이랄 분석 등은 시험하는데 많은 시행착오를 겪어야 하거나 적절 한 분석 조건을 심도 있게 조사(Scouting)해야 하는 등 어려움이 많습니다. 게다가 이 단계는 풍부한 경험과 전문 지식, 연구 시간(분석자의 분석 스킬에 의존적)이 요구되므로 Method scouting이 분석법 개발 속도를 지연하는 측면 중의 하나라고 할 수 있습니다.

    그림. 1 분석법 개발 단계

  2. 분석법 개발 새로운 분석법을 만들고 validation하는 것은 분석법 개발 부서와 생산 기술 부서의 중요한 업무입니다. 분석법 개발은 아래에 요약한 것처럼 기본적으로 4단계로 나눌 수 있으며, 그림.1에서 도식화하였습니다.

    <단계 1> Simulation 이 단계는 크로마토그래프에서의 화합물 동태을 예측하기 위해 이용되는 오프라인 과정입니다. 실제 분석 전에 구조식, pKa 등과 같은 화합물 정보에 근거하여 유지 시간 및 크로마토그램 양상을 예측할 수 있습니다. 일반적으로 잘 알려진 화합물에 대해 수행할 수 있습니다.
    <단계 2> Method Scouting 이 단계는 시료 내에 존재하는 다수의 성분을 충분히 분리할 수 있는 분석 조건을 찾기 위해 컬럼과 이동상을 철저하게 조사하는 과정입니다. 다양한 컬럼과 이동상을 가지고 분석 시험을 수행함으로써 최적의 조건(컬럼과 이동상 조합)을 탐색(Scouting)하도록 되어 있습니다. LC/MS의 경우, 이동상 첨가제 유형에 대한 제약(즉, 휘발성이어야 함)이 있어서 컬럼 선택이 중대한 요소가 됩니다.
    <단계 3> Method Optimization 이 단계는 시료 성분 간의 더 나은 분리능이나 분석 시간 단축을 위해 다양한 파라미터를 좀 더 최적화하는 과정입니다. Optimization은 2단계에서 선택된 컬럼과 이동상에 기초하여 수행됩니다. 어떤 경우에는 2단계에서 4단계로 진행되면서 이 단계를 생략하기도 합니다.
    <단계 4> Method Validation 이 단계는 분석법의 완건성을 입증하기 위해 분석에 사용하는 시험방법을 검증하는 단계입니다.
  3. Method Scouting의 제한 요인 Method scouting을 지연시키는 요인은 분석자 뿐만 아니라 시료에서도 기인하며 method scouting에 이용되는 시스템 또한 중요한 요인이 됩니다.

    그림. 2 이동상과 컬럼 준비

    그림.2과 같이 다양한 이동상(수용성 용매, 유기 용매)과 컬럼을 가지고 최적화된 분석 조건을 탐색할 때 더 많은 컬럼과 용매 선택을 위해 일반 LC 시스템에 용매와 컬럼 전환 밸브를 추가하는 것은 속도를 지연하는 요인이 됩니다. 왜냐하면 Method scouting은 각각의 분석 실행 동안 파라미터 값을 조금씩 변경시켜 연속적인 분석 시험을 하는 과정이기 때문에 어떤 용매나 컬럼을 추가하든지 간에 루틴한 분석과 많이 다른 분석을 하기 위해서는 충분한 시간이 요구됩니다. Method scouting 속도 제한의 주요한 요인은 그림.3에 나타내었습니다.

    그림. 3 Method Scouting 제한 요인

    위의 그림에 나타낸 9개의 제한 요인을 3개의 카테고리로 분류하였습니다.

    1. 복잡성– 이해하기 어려운 조작 → 복잡한 소프트웨어 조작
    1. 실수 – 시험 과정의 실수 →이동상 조제 과정 및/또는 데이터 분석 중의 실수
    1. 시간 – 비효율성 →분석 준비에서 평가 완료까지 장시간의 작업 시간

    그림.3의 (1)-(9)의 요인 중 어느 것 하나 무시할 수 없기 때문에 method scouting과 관련된 모든 속도 제한 요인은 반드시 제거되어야 합니다.

  4. Method Scouting의 제한 요인 그림.3의 (1) – (9)에 대한 구체적인 해결책은 표.1에 나타내었습니다.

    (A) 제한 요인* *이 내용은 그림.2와 동일함

    (B) 해결책

    성공적인 method scouting을 하려면 그러한 해결책을 제시할 수 있는 시스템이 필수적이며, SHIMADZU 시스템으로는 Nexera Method Scouting 시스템(초고성능 액체 크로마토그래프 method scouting 시스템)과 전용 Method Scouting Solution 소프트웨어 (그림.4)가 있습니다.

    그림. 4 Nexera Method Scouting

     
  5. Method Scouting의 제한 요인 Method Scouting Solution 소프트웨어는 표.1(B)에 설명된 특징이 내장되어 있어 누구라도 쉽고, 간편하게 분석 조건을 탐색할 수 있습니다.

    그림. 5 Method Scouting Solution의 메인 창

     

5-1. 복잡성 → 단순화

(1) 조건 설정 창 이 시스템의 작업은 주로 method scouting solution의 메인 창에서 실시됩니다. Wizards에 의존하는 다른 시스템과는 달리, 이 시스템은 분석자가 유로 diagram을 보면서 조건을 설정할 수 있는 간단한 인터페이스를 채택하였습니다.(2) 이동상 및 컬럼 선택 메인 창(그림.5)에서 이동상이나 컬럼 아이콘을 간단히 클릭하여 [Database]창(컬럼과 이동상 데이터베이스 창)을 자동 활성화시킵니다(그림.6). 데이터베이스에서 scouting에 사용할 이동상(수용성 용매, 유기 용매) 및 컬럼을 선택합니다. 이 창에서 데이터베이스로 이동상 및 컬럼 추가도 가능합니다.(3) Gradient 설정 Gradient 조건도 메인 창에서 설정합니다(그림.5). 다양한 gradient 조건을 가지고 연속적으로 시험을 실행하려면 [Advanced Setting] 버튼을 클릭하여 [Gradient]창(그림.7)을 표시합니다. 이 창은 그래프 화면으로 gradient 패턴을 보면서 설정이 가능하여 복잡한 gradient 패턴을 사용할 경우 모든 값이 정확히 입력되었는지 확인할 수 있습니다.

그림. 7 Gradient 패턴 설정 ([Gradient] 창)

5-2. 실수 → Mistake-free

큰 차이 없는 파라미터 값이 설정된 많은 분석법을 처리할 때 부주의로 인한 실수를 방지하는 것이 Method scouting에서 중요합니다. (4) 컬럼 연결 컬럼을 연결하는 tubing은 색깔로 표시된 태그로 식별할 수 있습니다(그림.9). 태그의 색은 소프트웨어 [Monitor]창(그림.8)의 ‘column icon’ 색과 상응하므로 연결한 컬럼에 대한 오류를 방지할 수 있습니다.

그림. 8 분석 중 [Monitor] 창

그림. 9 유로 식별

(5) 시료 및 이동상 제조 연속적인 일련의 분석에 필요한 시료와 이동상의 총량이 표시됩니다(그림.5(5)). 분석을 준비하는 동안 이 수치를 참조하면 분석 중에 시료나 이동상이 고갈되는 문제를 사전에 방지할 수 있습니다. (6) 분석 데이터 처리 및 리포트 작성 컬럼, 이동상, gradient 조건에 관한 정보가 자동 입력되고 분석 데이터 파일명과 함께 저장됩니다(그림.5(6)). 더 자세한 정보는 자동으로 출력 리포트로 제공됩니다(그림.10).

그림. 10 출력 리포트에 분석 조건이 자동적으로 게재

5-3. 시간 소모 → Quick

(7) Batch 설정 [Create Batch]버튼(그림.5(7))을 클릭하여 5-1.의 (1)-(3)순으로 설정하면 배치 파일이 자동 생성됩니다. 예를 들어, 표.2와 같이 일반적인 시스템에서는 960개의 서로 다른 분석 파일을 만드는데 32시간이 소요되지만 이 시스템을 이용하면 하나의 분석 파일을 만들어 거의 동시에 완성합니다. 마찬가지로 배치 파일을 만드는 경우도 일반적인 시스템에서는 보통 8시간이 걸리는데 반해 Nexera method scouting시스템은 거의 동시에 생성되기 때문에 시간을 줄일 수 있습니다.

표 2 Scouting 조건 설정에 요구되는 시간 비교

(8) 분석 시간 이 시스템은 Nexera UHPLC(초고성능 LC)의 기능을 바탕으로 제작되어서 기존 시스템과 비교하여 분석 시간을 현저히 단축시켰습니다. 또한 single LC/MS인 LCMS-2020과 LC/MS/MS인 LCMS-8030의 분석법 개발을 지원합니다(그림.11).

그림. 11 Nexera Method Scouting-LCMS 시스템

(9) Scouting 결과 평가 그림.12와 같이 Class-Agent와 CLASS-Agent Report 소프트웨어를 이용하면 scouting결과를 정량적으로 평가할 수 있습니다. CLASS-Agent Report 소프트웨어는 분석 결과로부터 필요한 값을 자동으로 추출하고 미리 준비된 템플릿으로 데이터를 불러 오면 그림.12와 같은 리포트가 자동으로 생성됩니다. 크로마토그램을 비교하기 위해 큰 용량의 분석 결과를 하나하나씩 인쇄하던 작업을 없애 노동력 절감을 촉진하고 종이 사용을 현저히 줄일 수 있습니다.

그림. 12 Scouting 결과 평가

  1. Nexera Method Scouting Application 사례 -카이랄 성분의 신속한 Method Scouting- 카이랄 컬럼 크로마토그래프는 의약품 개발 분야에서 활발히 연구되고 있는 컬럼 크로마토그래피의 변형된 방법으로 거울상 이성질체의 분리에 이용됩니다. 하지만, 이 방법의 한 가지 단점은 분석 물질을 분리하기 위해, 이동상 조건을 최적화 하고 다양한 카이랄 컬럼 중 적합한 컬럼을 결정하기 위해 방대한 시간과 노력을 소모한다는 점입니다.여기서는 iChiral-6 polysaccharide계 컬럼(Daicel社)과 Nexera Method Scouting system을 이용하여 최적화된 컬럼 조건을 가지고 카이랄 성분의 고분리능(high-resolution) 분석한 사례를 소개하고자 합니다. 6-1. 개요

    순수한 형태(거울상)의 카이랄 화합물을 생물학적으로 응용(특히 제약 분야에서 사용)하기 위해서는 그 성분의 안전성이 필수적입니다. 하나의 거울상 이성질체는 해로운 독성을 가지는 반면 다른 하나의 거울상 이성질체는 약효 특성을 가지는 경우가 종종 있기 때문에 이러한 거울상 이성질체는 완전히 분리하는 것이 중요합니다. HPLC에 의한 광학 분리(카이랄 분리)는 일반적으로 카이랄 화합물을 얻기 위해 이용되는 분석법 중의 하나입니다. 이 HPLC 방법은 특정한 카이랄 화합물 분석에 적합한 이동상과 컬럼을 탐색하는 Method scouting 과정에서 노동 집약적이고 많은 시간적 소모를 수반합니다. 최근 약물 합성 및 의약품 중간체 생산 속도를 높이기 위해 이러한 Method scouting 과정의 가 속화에 많은 노력을 기울이고 있습니다. 초고성능 액체크로마토그래피(Ultra high performance liquid chromatography, UHPLC)는 생산성 및 효율성을 향상함으로써 분석 처리량을 증가시킬 수 있는 HPLC 기술로 많은 관심을 받고 있습니 다. 또한, 용매 소비를 최소화하면서 전체적인 처리량을 증가시키는 수단으로서 Method scouting을 위해 UHPLC 도입이 촉진되고 있습니다. 이 Technical report에서는 3개의 카이랄 화합물(bromacil, α-methyl-α-acethyl-γ-butylrolactone, methylclothiazide)의 분석 결과를 소개하고 있습니다. 6-2. 실험 6-2-1. 시스템 그림.1은 이 실험을 위해 구성된 Nexera Method scouting 시스템의 흐름도입니다. 초고성능 펌프 각 내부에 용매 전환 밸브를 설치하고 오븐 내부에 컬럼 전환 밸브를 설치한 시스템입니다. 이렇게 구성함으로써 컬럼과 이동상의 최대 96개의 조합을 지속적으로 전환해가면서 광범위한 데이터 수집이 가능해졌습니다.

    그림. 1 Nexera Method Scouting 시스템의 흐름도

    6-2-2. 시료 정보 그림.2와 같이 3개의 카이랄 화합물 표준 물질 (bromacil, α-methyl-α-acethyl-γ-butylrolactone, methylclothiazide)을 분석하였습니다. 이 표준 물질은 Hexane과 MTBE로 녹여 1.0 mg/mL의 농도로 분석하였습니다.

    그림. 2 카이랄 화합물의 구조식

    6-2-3. 카이랄 컬럼 표시된 카이랄 화합물의 고분리능 조건을 제공하기 위해 Caicel社의 iChiral-6 high-resolution polysaccharide계 컬럼 (CHIRALPAK®IA/IB/IC/ID/IE/IF)을 이용하였습니다. 그림.3은 각각의 컬럼 작용기를 나타내었습니다. (A)~(F)의 iChiral-6 컬럼은 이 실험에 지정된 유기 용매와 호환되기 때문에 카이랄 화합물의 method scouting 분석이 가능합니다.

    그림. 3 카이랄 작용기

    6-2-4. 분리조건 hexane, 2-propanol, ethanol, dichloromethane, methyl-t-butyl ether를 가지고 각기 다른 비율로 조합하여 제조한 8개의 혼합 용매를 이동상으로 이용하였습니다. 상세한 분리 조건은 표.1에 나타내었습니다. 8개의 이동상과 6개의 컬럼을 이용한 48개의 분리 조건으로 각각의 카이랄 화합물 분리에 적합한 조건을 철저하게 탐색할 수 있습니다.

    표 1 분석 조건 Note: methylclothiozide를 분석하기 위해 0.1% diethylamine이 각 이동상에 첨가되었습니다.

    6-3. 결과 그림.4는 총 48개의 조건을 가지고 bromacil을 분석한 크로마토그램이고, 그림.5는 3개의 카이랄 화합물에 대한 각각의 최적 조건을 나타내었습니다.

    그림. 4 Method Scouting Results for Bromacil

    그림. 5 Bromacil, α-Methyl-α-Acetyl-γ-Butyloractone, Methylclothiazide의 크로마토그램

    6-4. 분석

    그림. 6 CLASS-Agent Report로 크로마토그램의 정량 비교

    표 2 Methylclothiazide 분석 결과

    6-5. 결론 Nexera Method Scouting 시스템과 iChiral-6 high-resolution polysaccharide계 컬럼을 이용하여 3개의 카이랄 화합물에 대한 최적의 분리 조건(컬럼, 이동상)을 신속하게 결정할 수 있었습니다. 또한, CLASS-Agent Report를 이용하여 각 크로마토그램의 분리능(Resolution) 및 대칭계수를 나타내는 수치를 비교함으로써 크로마토그램의 비교 평가뿐만 아니라 효율적으로 데이터 분석을 시각적으로 비교할 수 있었습니다. 이 연구에 사용된 시스템과 컬럼은 카이랄 분석이 필수적인 의약품 중간체 분야나 합성 신약 개발 분야, 제약 CMC 부서의 새로운 분석법 개발, 화학 및 식품 R&D를 포함한 다양한 시장에 유용할 것으로 사료됩니다.